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實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)的主要應(yīng)用有哪些?

依鉦生物 / 2018-02-09

所謂Real-Time PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。real-time PCR技術(shù)即實(shí)時(shí)熒光定量PCR避免了傳統(tǒng)PCR以終產(chǎn)物監(jiān)測(cè)定量產(chǎn)生的偏差,提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。該技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化;比較不同組織的mRNA表達(dá)差異;驗(yàn)證基因芯片,siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。


實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)的主要應(yīng)用

1. DNA 或RNA 的絕對(duì)定量分析:包括病原微生物或病毒含量的檢測(cè),轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測(cè),RNAi 基因失活率的檢測(cè)等;

2. 基因表達(dá)差異分析:例如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異(如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等 ),特定基因在不同時(shí)相的表達(dá)差異以及CDNA 芯片或差顯結(jié)果的確證;

3. 基因分型:例如SNP 檢測(cè),甲基化檢測(cè)等。


Realtime PCR 常用的兩種方法分別為Sybr green(熒光染料摻入法)和Taqman probe (探針法)。


SYBR green
在PCR反應(yīng)體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,發(fā)射熒光信號(hào),而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào),從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

此方法適用于:

1、靈敏度高:使用SYBR可使熒光效果增強(qiáng)到1000倍以上

2、通用性好,不需要設(shè)計(jì)探針,方法簡便,省時(shí),價(jià)格低廉。

3、通用型方法,在國內(nèi)外科研中普遍使用。

4、高通量大規(guī)模的定量PCR檢測(cè)

5、專一性要求不高的定量PCR檢測(cè)。


Taqman Probe
PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時(shí),Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步

此方法適用于:

1、具有高適應(yīng)性和可靠性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定重復(fù)性好,特異性更高。

2、適用于擴(kuò)增序列專一的體系的檢測(cè)。

3、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測(cè)。

4、靶基因的特異序列較短,無論怎樣優(yōu)化引物設(shè)計(jì)條件都不能解決。

5、存在與靶基因同源的序列,在PCR中容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,對(duì)特異性要求較高的定量。

6、廣泛用于人類傳染病的診斷和病原定量,在動(dòng)物病原體基因的檢測(cè),畜禽產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫,生物制品的鑒定。

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